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豬用生物制品及相關豬源原輔材料中
非洲豬瘟病毒核酸檢測方法
1 適用范圍
1.1豬用及采用豬源原輔材料制備的生物制品成品及半成品。
1.2豬源毒種。
1.3 豬源細胞及相關制品生產(chǎn)用細胞。
1.4其他豬源原輔材料(如組織、血清、胰酶衍生物等)。
2 取樣和處理
2.1 疫苗
2.1.1 活疫苗 取至少2瓶樣品,按瓶簽注明頭份用適宜稀釋液分別稀釋成10頭份/0.2ml,等量混合,取混合液進行核酸提取。
2.1.2 滅活疫苗 取至少2瓶樣品,等量混合后進行以下處理。
2.1.2.1 油佐劑滅活疫苗 取36 ml混合疫苗,加入正戊醇4.0 ml,充分振蕩混合1分鐘,2~8℃冰箱靜置不少于60分鐘,直至油相和水相分離。取水相進行核酸提取。
2.1.2.2 水性佐劑滅活疫苗
2.1.2.2.1鋁膠佐劑滅活疫苗 取混合疫苗5.0 ml,搖勻,加入0.25 g解離劑CPG-odn(人工合成的寡聚核苷酸),放入搖床(200 r/min)37℃解離1小時,5000 r/min離心10分鐘,取上清液進行核酸提取。
2.1.2.2.2其他水性佐劑滅活疫苗 直接取混合樣品進行核酸提取。
2.2 其他生物制品和半成品凍干類制品,按活疫苗進行取樣和處理;液體制品及半成品,取至少2份(瓶)樣品,等量混合,取混合液進行核酸提取。
2.3 豬源毒種 取至少2支毒種。凍干毒種,按凍干前體積復溶后等量混合,取混合液進行核酸提?。环莾龈啥痉N,等量混合后直接取混合液進行核酸提取。
2.4 豬源細胞 除另有規(guī)定外,取至少2瓶細胞濃度不少于107.0個細胞/ml的細胞懸液進行核酸提取。
2.5 其他豬源原輔材料
2.5.1 豬組織 每種組織,分別取樣和處理。取不少于2.0 g組織,研磨后用5倍體積滅菌PBS懸浮,70℃滅活30分鐘,4℃下以2000~3000 g離心10分鐘,取上清液進行核酸提取。
2.5.2 豬血清 每批血清取至少2個最小包裝的樣品,等量混合,取混合液進行核酸提取。
2.5.3 豬胰酶 干粉狀胰酶,取至少2份樣品,根據(jù)使用情況分別配制成不低于2.5%濃度的溶液,等量混合,取混合液進行核酸提取;液體胰酶,取至少2個最小包裝的樣品,等量混合,取混合液進行核酸提取。
2.5.4 其他豬源衍生物 固體、液體或干粉狀豬源衍生物,可分別按組織、血清或干粉狀胰酶的方法進行取樣和樣品處理。
3 核酸提取
3.1 試劑和器材
3.1.1 試劑 根據(jù)核酸提取方法確定,如氯仿、異丙醇、無水乙醇、0.1 mol/l 檸檬酸鈉(含10%乙醇)、75%乙醇等。
3.1.2 儀器 核酸含量測定儀;常溫臺式離心機;旋渦振蕩器;水浴鍋;微量移液器1套(最大量程分別為10 μl、100 μl、200 μl、1000 μl)。
3.1.3 耗材 1.5 ml帶蓋離心管、無菌吸頭(0~10 μl、0~200 μl、100~1000 μl)、一次性乳膠手套。
3.2 操作程序(TRIZOL法),也可以選擇其他等效核酸提取方法提取樣品中的DNA。
3.2.1 取樣品250 μl,加入750 μl Trizol,顛倒混勻,室溫放置5分鐘。
3.2.2 加入200 μl氯仿,充分混勻,室溫放置10 分鐘,4℃下以12000 g離心15 分鐘。
3.2.3 棄去上清液,加入220 μl無水乙醇,顛倒混合,15~30℃放置2~3分鐘,2~8℃以2000 g離心5分鐘,沉淀物為DNA。
3.2.4 棄去上清液,加入含10%乙醇的0.1 mol/l 檸檬酸鈉750 μl洗滌DNA,15~30℃放置30分鐘,2~8℃以2000 g離心5分鐘。重復一次。
3.2.5 加入75%乙醇1.2 ml,重懸DNA沉淀,15~30℃放置20分鐘,4℃2000 g離心5分鐘??芍貜鸵淮?,充分洗滌DNA沉淀。
3.2.6 棄去上清液,敞開離心管管口,在空氣中干燥5~10分鐘,加入30~50 μl的無核酸酶滅菌水溶解DNA,-20℃以下保存?zhèn)溆谩?/span>
3.3 注意事項
3.3.1核酸提取試劑具有腐蝕和強變性能力,應做好個人防護,佩戴手套、口罩和護目鏡,防止液體飛濺到皮膚和眼睛。
3.3.2后續(xù)的核酸檢測敏感性很高,要防止樣品之間相互污染,最好使用帶濾芯的槍頭,且每次吸取取液體時均需更換槍頭。
3.3.3為防止核苷酸降解,應避免核酸酶污染,使用的耗材均需無核酸酶。
3.3.4做好剩余樣品的無害化處理及操作臺面的消毒處理。剩余樣品可通過高壓滅菌或煮沸處理,也可放在1%衛(wèi)可或2%氫氧化鈉消毒液中浸泡處理,操作臺面使用1%衛(wèi)可擦拭。
3.3.5提取后的DNA樣品要用錫箔紙封存,取樣時應用槍頭直接刺破錫箔紙取樣,防止污染。
4 檢測
下列兩種方法可任選其一。
4.1 實時熒光定量PCR檢測法
4.1.1 試劑和器材
4.1.1.1 試劑
4.1.1.1.1 熒光定量PCR試劑 本操作中以Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays kit為例,也可選用其他熒光定量PCR試劑。
4.1.1.1.2 擴增引物及探針
擴增引物:
ASF-05-Zsak-1466F(10 μmol/ L):5'-CCTCGGCGAGCGCTTTATCAC-3'
ASF-05-Zsak-1528R(10 μmol/ L):5'-GGAAACTCATTCACCAAATCCTT-3'
探針ASF-05-Zsak-1486prob (10 μmol/ L):5'-FAM-CGATGCAAGCTTTAT-MGB-3'
4.1.1.1.3 無核酸酶的滅菌水 PCR級別。
4.1.1.2 儀器 熒光定量PCR儀;微量移液器1套(最大量程分別為10 μl、100 μl、200 μl、1000 μl)。
4.1.1.3 耗材 1.5 ml帶蓋離心管、0.2 ml薄壁PCR管、熒光定量PCR 96孔板、0.1 ml熒光PCR八連管、無菌吸頭(0~10 μl、0~200 μl、100~1000 μl)、一次性乳膠手套。
4.1.2 操作程序
4.1.2.1 樣品DNA制備 按照前述方法進行核酸提取。
4.1.2.2 反應體系的配制 配制比樣品數(shù)量至少多4個的反應體系,同時設置強陽性、弱陽性和陰性對照。在強陽性和弱陽性對照反應管中分別加入含有非洲豬瘟P72基因的標準質(zhì)粒DNA各3 μl,在陰性對照反應管中加入3μl無核酸酶滅菌水。每個PCR反應管中應包含以下成分:
成分 |
體積(μl) |
2×ABI TaqMan Gene ExpressionMix |
10 |
ASF-05-Zsak-1466F(10 μmol/ L) |
1 |
ASF-05-Zsak-1528R(10 μmol/ L) |
1 |
探針(10 μmol/ L) |
0.8 |
DNA |
3 |
無核酸酶滅菌水 |
4.2 |
|
總量20 |
4.1.2.3 反應程序 將所有待檢樣品和強陽性、弱陽性、陰性對照反應管放在熒光定量PCR儀中,按照以下程序進行擴增:50℃2分鐘,95℃5分鐘,95℃15秒,58℃退火延伸1分鐘,45個循環(huán)(熒光信號收集在此階段每次循環(huán)的退火延伸時進行)。
4.1.2.4 結(jié)果判定
4.1.2.4.1 閾值設定 試驗操作結(jié)束后,確定Ct值。Ct值為每個樣品反應管內(nèi)熒光信號到達設定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
閾值設定原則:根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整,以閾值線剛好超過陰性對照擴增曲線的最高點為準。
4.1.2.4.2 質(zhì)控標準
對照組的檢測結(jié)果應符合以下情況,此次檢測方為有效:
陰性對照無Ct 值,且無擴增曲線。
強陽性對照的Ct 值應在18~22之間,并出現(xiàn)典型的擴增曲線。弱陽性對照的Ct 值應在33~35之間,并出現(xiàn)典型的擴增曲線。
4.1.2.4.3 判定
陰性:無Ct值,且未出現(xiàn)擴增曲線,判定為樣品中無ASFV核酸。
陽性:Ct值≤40,且出現(xiàn)典型的擴增曲線,判定為樣品中存在ASFV核酸。
可疑:Ct值>40,且出現(xiàn)典型擴增曲線,判定為可疑,應重檢。重檢后,Ct值≤40且出現(xiàn)典型擴增曲線者判為陽性,其他情況均判定為陰性。
4.2 普通 PCR檢測法
4.2.1 試劑和器材
4.2.1.1 試劑
4.2.1.1.1 PCR試劑 10×PCR緩沖液(含25 mmol/l Mg2+),DNA擴增酶,dNTP預混液。
4.2.1.1.2擴增引物
primer PPA-1(10 μmol/L):5'-AGTTATGGGAAACCCGACCC-3' (上游引物);
primer PPA-2(10 μmol/L):5'- CCCTGAATCGGAGCATCCT-3' (下游引物)。
4.2.1.1.3 DNA分子量標準品 DL500。
4.2.1.1.4 TAE電泳緩沖液 配制方法見《電泳液標準配制流程》。
4.2.1.1.5 1%瓊脂糖凝膠板 在100 ml 1×TAE緩沖液中加入1g瓊脂糖,加熱融化,加入5.0 μl (10 mg/ml)溴化乙錠,混勻,倒入水平放置的凝膠盤中,膠板厚度達5.0 mm左右。根據(jù)樣品數(shù)量選用適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子(膠中形成加樣孔),放入電泳槽中,加1×TAE緩沖液淹沒膠面。
4.2.1.2 儀器 DNA擴增儀,穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀,水平電泳槽,凝膠成相系統(tǒng)(或紫外透射儀),微量移液器1套。
4.2.1.3 耗材 1.5 ml帶蓋離心管、0.2 ml薄壁PCR管、無菌吸頭(0~10 μl、0~200 μl、100~1000 μl)。
4.2.2 操作程序
4.2.2.1 樣品DNA制備 按照前述方法進行核酸提取。
4.2.2.2 反應體系的配制 配制比樣品數(shù)量至少多3個的反應體系,同時設立陽性和陰性對照。在陽性對照反應管中加入非洲豬瘟P72基因重組質(zhì)粒2.0 μl,在陰性對照反應管中加入2.0 μl無核酸酶滅菌水。每個PCR反應管中應包含以下成分:
|
體積(μl) |
10×PCR緩沖液 |
2 |
DNA 擴增酶 |
1 |
dNTP |
0.5 |
PPA-1 (10 μmol/L) |
1 |
PPA-2 (10 μmol/L) |
1 |
DNA |
2 |
無核酸酶滅菌水 |
12.5 |
|
總量20 |
4.2.2.3 反應程序 將所有待檢樣品及陽性和陰性對照反應管放在PCR儀中,按照以下程序進行擴增:94℃2分鐘,94℃30秒,60℃30秒,72℃30秒,35個循環(huán);72℃10分鐘。4℃保存。
4.2.2.4 PCR擴增產(chǎn)物分析 取PCR擴增產(chǎn)物10 μl,加6×加樣緩沖液2.0 μl,混勻,用1.5%瓊脂糖凝膠對混合物進行電泳分析,電壓120V,電流50 mA,電泳時間30分鐘。電泳結(jié)束后,用凝膠成像系統(tǒng)拍照,記錄檢測結(jié)果。
4.2.2.5 結(jié)果判定
4.2.2.5.1 質(zhì)控標準
對照組的檢測結(jié)果應符合以下情況,此次檢測方為有效:
陰性對照應不出現(xiàn)257bp的特異性條帶。
陽性對照應出現(xiàn)257bp的特異性條帶。
4.2.2.5.2 判定
陽性:待檢樣品出現(xiàn)與陽性對照大小一致的擴增條帶,判定為非洲豬瘟病毒核酸陽性,擴增產(chǎn)物可通過DNA測序進一步確定基因型。
陰性:待檢樣品未出現(xiàn)與陽性對照大小一致的擴增條帶,判定為非洲豬瘟病毒核酸陰性。
4.3 注意事項
4.3.1檢測過程中應遵循PCR實驗分區(qū)原則,即應區(qū)分試劑配制區(qū)、樣本處理區(qū)、核酸擴增區(qū)。
4.3.2應避免在含有靶序列的區(qū)域中使用引物,防止污染靶序列。
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