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豬用生物制品及相關豬源原輔材料中 非洲豬瘟病毒核酸檢測方法
發(fā)布時間:2019/5/21 13:57:07 發(fā)布者:農(nóng)業(yè)農(nóng)村部

豬用生物制品及相關豬源原輔材料中

  非洲豬瘟病毒核酸檢測方法

 

1  適用范圍

1.1豬用及采用豬源原輔材料制備的生物制品成品及半成品。

1.2豬源毒種。 

1.3 豬源細胞及相關制品生產(chǎn)用細胞。

1.4其他豬源原輔材料(如組織、血清、胰酶衍生物等)。

2  取樣和處理

2.1 疫苗

2.1.1  活疫苗  取至少2瓶樣品,按瓶簽注明頭份用適宜稀釋液分別稀釋成10頭份/0.2ml,等量混合,取混合液進行核酸提取。

2.1.2  滅活疫苗  取至少2瓶樣品,等量混合后進行以下處理。

2.1.2.1 油佐劑滅活疫苗  36 ml混合疫苗,加入正戊醇4.0 ml,充分振蕩混合1分鐘,2~8℃冰箱靜置不少于60分鐘,直至油相和水相分離。取水相進行核酸提取。

2.1.2.2 水性佐劑滅活疫苗

2.1.2.2.1鋁膠佐劑滅活疫苗  取混合疫苗5.0 ml,搖勻,加入0.25 g解離劑CPG-odn(人工合成的寡聚核苷酸),放入搖床(200 r/min)37℃解離1小時,5000 r/min離心10分鐘,取上清液進行核酸提取。

2.1.2.2.2其他水性佐劑滅活疫苗  直接取混合樣品進行核酸提取。

2.2 其他生物制品和半成品凍干類制品,按活疫苗進行取樣和處理;液體制品及半成品,取至少2份(瓶)樣品,等量混合,取混合液進行核酸提取。

2.3 豬源毒種  取至少2支毒種。凍干毒種,按凍干前體積復溶后等量混合,取混合液進行核酸提?。环莾龈啥痉N,等量混合后直接取混合液進行核酸提取。

2.4 豬源細胞  除另有規(guī)定外,取至少2瓶細胞濃度不少于107.0個細胞/ml的細胞懸液進行核酸提取。

2.5 其他豬源原輔材料

2.5.1 豬組織  每種組織,分別取樣和處理。取不少于2.0 g組織,研磨后用5倍體積滅菌PBS懸浮,70℃滅活30分鐘,4℃下以2000~3000 g離心10分鐘,取上清液進行核酸提取。

2.5.2 豬血清  每批血清取至少2個最小包裝的樣品,等量混合,取混合液進行核酸提取。

2.5.3 豬胰酶  干粉狀胰酶,取至少2份樣品,根據(jù)使用情況分別配制成不低于2.5%濃度的溶液,等量混合,取混合液進行核酸提取;液體胰酶,取至少2個最小包裝的樣品,等量混合,取混合液進行核酸提取。

2.5.4 其他豬源衍生物  固體、液體或干粉狀豬源衍生物,可分別按組織、血清或干粉狀胰酶的方法進行取樣和樣品處理。

3  核酸提取

3.1 試劑和器材

3.1.1 試劑  根據(jù)核酸提取方法確定,如氯仿、異丙醇、無水乙醇、0.1 mol/l 檸檬酸鈉(含10%乙醇)、75%乙醇等。

3.1.2 儀器  核酸含量測定儀;常溫臺式離心機;旋渦振蕩器;水浴鍋;微量移液器1套(最大量程分別為10 μl、100 μl、200 μl、1000 μl)。

3.1.3 耗材  1.5 ml帶蓋離心管、無菌吸頭(0~10 μl、0~200 μl、100~1000 μl)、一次性乳膠手套。

3.2  操作程序(TRIZOL法),也可以選擇其他等效核酸提取方法提取樣品中的DNA。

3.2.1 取樣品250 μl,加入750 μl Trizol,顛倒混勻,室溫放置5分鐘。

3.2.2 加入200 μl氯仿,充分混勻,室溫放置10 分鐘,4℃下以12000 g離心15 分鐘。

3.2.3 棄去上清液,加入220 μl無水乙醇,顛倒混合,15~30℃放置2~3分鐘,2~8℃以2000 g離心5分鐘,沉淀物為DNA。

3.2.4 棄去上清液,加入含10%乙醇的0.1 mol/l 檸檬酸鈉750 μl洗滌DNA,15~30℃放置30分鐘,2~8℃以2000 g離心5分鐘。重復一次。

3.2.5 加入75%乙醇1.2 ml,重懸DNA沉淀,15~30℃放置20分鐘,4℃2000 g離心5分鐘??芍貜鸵淮?,充分洗滌DNA沉淀。

3.2.6 棄去上清液,敞開離心管管口,在空氣中干燥5~10分鐘,加入30~50 μl的無核酸酶滅菌水溶解DNA,-20℃以下保存?zhèn)溆谩?/span>

3.3  注意事項

3.3.1核酸提取試劑具有腐蝕和強變性能力,應做好個人防護,佩戴手套、口罩和護目鏡,防止液體飛濺到皮膚和眼睛。

3.3.2后續(xù)的核酸檢測敏感性很高,要防止樣品之間相互污染,最好使用帶濾芯的槍頭,且每次吸取取液體時均需更換槍頭。

3.3.3為防止核苷酸降解,應避免核酸酶污染,使用的耗材均需無核酸酶。

3.3.4做好剩余樣品的無害化處理及操作臺面的消毒處理。剩余樣品可通過高壓滅菌或煮沸處理,也可放在1%衛(wèi)可或2%氫氧化鈉消毒液中浸泡處理,操作臺面使用1%衛(wèi)可擦拭。

3.3.5提取后的DNA樣品要用錫箔紙封存,取樣時應用槍頭直接刺破錫箔紙取樣,防止污染。

4  檢測

下列兩種方法可任選其一。

4.1  實時熒光定量PCR檢測法

4.1.1 試劑和器材

4.1.1.1 試劑

4.1.1.1.1 熒光定量PCR試劑  本操作中以Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays kit為例,也可選用其他熒光定量PCR試劑。

4.1.1.1.2 擴增引物及探針

擴增引物:

ASF-05-Zsak-1466F(10 μmol/ L):5'-CCTCGGCGAGCGCTTTATCAC-3'

ASF-05-Zsak-1528R(10 μmol/ L):5'-GGAAACTCATTCACCAAATCCTT-3'

探針ASF-05-Zsak-1486prob (10 μmol/ L):5'-FAM-CGATGCAAGCTTTAT-MGB-3'

4.1.1.1.3  無核酸酶的滅菌水  PCR級別。

4.1.1.2  儀器  熒光定量PCR儀;微量移液器1套(最大量程分別為10 μl、100 μl、200 μl、1000 μl)。

4.1.1.3 耗材  1.5 ml帶蓋離心管、0.2 ml薄壁PCR管、熒光定量PCR 96孔板、0.1 ml熒光PCR八連管、無菌吸頭(0~10 μl、0~200 μl、100~1000 μl)、一次性乳膠手套。

4.1.2  操作程序

4.1.2.1 樣品DNA制備  按照前述方法進行核酸提取。

4.1.2.2 反應體系的配制  配制比樣品數(shù)量至少多4個的反應體系,同時設置強陽性、弱陽性和陰性對照。在強陽性和弱陽性對照反應管中分別加入含有非洲豬瘟P72基因的標準質(zhì)粒DNA3 μl,在陰性對照反應管中加入3μl無核酸酶滅菌水。每個PCR反應管中應包含以下成分:

成分

體積(μl

ABI TaqMan Gene ExpressionMix

10

ASF-05-Zsak-1466F10 μmol/ L

1

ASF-05-Zsak-1528R10 μmol/ L

1

探針(10 μmol/ L)

0.8

DNA

3

無核酸酶滅菌水

4.2

 

總量20

4.1.2.3  反應程序  將所有待檢樣品和強陽性、弱陽性、陰性對照反應管放在熒光定量PCR儀中,按照以下程序進行擴增:50℃2分鐘,95℃5分鐘,95℃15秒,58℃退火延伸1分鐘,45個循環(huán)(熒光信號收集在此階段每次循環(huán)的退火延伸時進行)。

4.1.2.4  結(jié)果判定

4.1.2.4.1  閾值設定  試驗操作結(jié)束后,確定Ct值。Ct值為每個樣品反應管內(nèi)熒光信號到達設定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

閾值設定原則:根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整,以閾值線剛好超過陰性對照擴增曲線的最高點為準。

4.1.2.4.2  質(zhì)控標準

對照組的檢測結(jié)果應符合以下情況,此次檢測方為有效:

陰性對照無Ct 值,且無擴增曲線。

強陽性對照的Ct 值應在18~22之間,并出現(xiàn)典型的擴增曲線。弱陽性對照的Ct 值應在33~35之間,并出現(xiàn)典型的擴增曲線。

4.1.2.4.3  判定

陰性:無Ct值,且未出現(xiàn)擴增曲線,判定為樣品中無ASFV核酸。

陽性:Ct值≤40,且出現(xiàn)典型的擴增曲線,判定為樣品中存在ASFV核酸。

可疑:Ct值>40,且出現(xiàn)典型擴增曲線,判定為可疑,應重檢。重檢后,Ct值≤40且出現(xiàn)典型擴增曲線者判為陽性,其他情況均判定為陰性。

4.2  普通 PCR檢測法

4.2.1  試劑和器材

4.2.1.1  試劑

4.2.1.1.1 PCR試劑  10×PCR緩沖液(含25 mmol/l  Mg2+),DNA擴增酶,dNTP預混液。

4.2.1.1.2擴增引物

primer PPA-1(10 μmol/L):5'-AGTTATGGGAAACCCGACCC-3' (上游引物);

primer PPA-2(10 μmol/L):5'- CCCTGAATCGGAGCATCCT-3' (下游引物)。

4.2.1.1.3  DNA分子量標準品  DL500。

4.2.1.1.4  TAE電泳緩沖液  配制方法見《電泳液標準配制流程》。

4.2.1.1.5  1%瓊脂糖凝膠板  100 ml 1×TAE緩沖液中加入1g瓊脂糖,加熱融化,加入5.0 μl (10 mg/ml)溴化乙錠,混勻,倒入水平放置的凝膠盤中,膠板厚度達5.0 mm左右。根據(jù)樣品數(shù)量選用適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子(膠中形成加樣孔),放入電泳槽中,加1×TAE緩沖液淹沒膠面。

4.2.1.2 儀器  DNA擴增儀,穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀,水平電泳槽,凝膠成相系統(tǒng)(或紫外透射儀),微量移液器1套。

4.2.1.3 耗材  1.5 ml帶蓋離心管、0.2 ml薄壁PCR管、無菌吸頭(0~10 μl、0~200 μl、100~1000 μl)。

4.2.2 操作程序

4.2.2.1 樣品DNA制備  按照前述方法進行核酸提取。

4.2.2.2 反應體系的配制  配制比樣品數(shù)量至少多3個的反應體系,同時設立陽性和陰性對照。在陽性對照反應管中加入非洲豬瘟P72基因重組質(zhì)粒2.0 μl,在陰性對照反應管中加入2.0 μl無核酸酶滅菌水。每個PCR反應管中應包含以下成分:


成分

體積(μl

10×PCR緩沖液

2

DNA 擴增酶

1

dNTP

0.5

PPA-1 (10 μmol/L)

1

PPA-2  (10 μmol/L)

1

DNA

2

無核酸酶滅菌水

12.5

 

總量20

4.2.2.3  反應程序  將所有待檢樣品及陽性和陰性對照反應管放在PCR儀中,按照以下程序進行擴增:94℃2分鐘,94℃30秒,60℃30秒,72℃30秒,35個循環(huán);72℃10分鐘。4℃保存。

4.2.2.4  PCR擴增產(chǎn)物分析  PCR擴增產(chǎn)物10 μl,加6×加樣緩沖液2.0 μl,混勻,用1.5%瓊脂糖凝膠對混合物進行電泳分析,電壓120V,電流50 mA,電泳時間30分鐘。電泳結(jié)束后,用凝膠成像系統(tǒng)拍照,記錄檢測結(jié)果。

4.2.2.5 結(jié)果判定

4.2.2.5.1 質(zhì)控標準

對照組的檢測結(jié)果應符合以下情況,此次檢測方為有效:

陰性對照應不出現(xiàn)257bp的特異性條帶。

陽性對照應出現(xiàn)257bp的特異性條帶。

4.2.2.5.2 判定

陽性:待檢樣品出現(xiàn)與陽性對照大小一致的擴增條帶,判定為非洲豬瘟病毒核酸陽性,擴增產(chǎn)物可通過DNA測序進一步確定基因型。

陰性:待檢樣品未出現(xiàn)與陽性對照大小一致的擴增條帶,判定為非洲豬瘟病毒核酸陰性。

4.3  注意事項

4.3.1檢測過程中應遵循PCR實驗分區(qū)原則,即應區(qū)分試劑配制區(qū)、樣本處理區(qū)、核酸擴增區(qū)。

4.3.2應避免在含有靶序列的區(qū)域中使用引物,防止污染靶序列。

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